用于病毒復(fù)制研究的正置熒光顯微鏡
冠狀病毒2致重度急性呼吸綜合征(SARS-CoV-2)出現(xiàn)于2019年末，并快速傳播全球。由于其大面積的影響，研究人員對(duì)病毒的性質(zhì)進(jìn)行了深入的研究以期最終阻止大流行。一個(gè)重要的方面是病毒如何在宿主細(xì)胞中復(fù)制。Ogando及其同事的研究已經(jīng)揭示了SARS-CoV-2的復(fù)制動(dòng)力學(xué)、適應(yīng)能力和細(xì)胞病理學(xué)。他們的工具之一是用熒光顯微鏡觀察SARS-CoV-2感染的VeroE6細(xì)胞。通過使用前一段時(shí)間產(chǎn)生的抗SARS-CoV（2002）的抗體，他們發(fā)現(xiàn)了與SARS-CoV-2的強(qiáng)烈交叉反應(yīng)。因此，他們建立了一種通過免疫熒光顯微成像研究SARS-CoV-2復(fù)制的工具。

   
用于病毒觀察的顯微鏡
病毒可以借助幾種顯微鏡技術(shù)進(jìn)行研究。根據(jù)顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率，可以在組織水平、細(xì)胞水平或病毒粒子水平進(jìn)行觀察（圖1）。通常，病毒粒子本身只能通過電子顯微鏡或超分辨顯微鏡來分辨。在細(xì)胞水平上，病毒大多借助先進(jìn)的寬場熒光或共焦顯微鏡進(jìn)行觀察。在組織中，明場顯微鏡或基本的寬場熒光顯微鏡足以用于病毒研究。但是顯微技術(shù)的鑒別并不是嚴(yán)格的。

光學(xué)數(shù)字圖像處理工具如ICC光學(xué)圖像解析等可以幫助提高背景信號(hào)比，減少離焦模糊。相關(guān)的對(duì)比度增強(qiáng)可以揭示顯微圖像中的附加信息。



圖1: 病毒可從組織到單個(gè)病毒顆粒的不同層面進(jìn)行觀察。對(duì)于這種方法，需要明顯的放大倍數(shù)和分辨率。因此，研究人員選擇了一種適合他們需要的顯微鏡技術(shù)。

病毒蛋白的免疫熒光檢查
在測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)和電子顯微鏡中，Ogando等人通過熒光顯微鏡分析了感染細(xì)胞：VeroE6細(xì)胞生長在玻璃蓋玻片上，感染SARS-CoV-2，并用多聚甲醛固定。然后，用事先暴露于SARS-CoV的兔子或小鼠的抗血清孵育細(xì)胞（圖2）。用熒光標(biāo)示的二級(jí)抗體檢測(cè)與veroe6細(xì)胞SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)結(jié)合的SARS-CoV源性抗體。此外，細(xì)胞核用Hoechst染色。用DM6 B直立熒光顯微鏡進(jìn)行熒光成像。



圖2: Ogando等人的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)涉及使用免疫熒光顯微鏡對(duì)VeroE6細(xì)胞成像。在2002/2003年SARS爆發(fā)期間，他們大體上探索了在兔子身上制備抗SARS-CoV抗血清的潛力。他們使用不同的兔抗血清作為第一組抗體。然后，用第二組熒光抗體標(biāo)記這些兔抗血清。隨后，用DM6 B顯微鏡進(jìn)行熒光顯微鏡檢查。
SARS-CoV抗血清與SARS-CoV-2的交叉反應(yīng)

免疫熒光顯微鏡顯示，許多SARS-CoV抗血清在SAR-SCoV-2感染細(xì)胞（病毒蛋白nsp3、nsp4、nsp5、nsp8、nsp9、nsp13、nsp15、N、M）中具有交叉反應(yīng)性。這一事實(shí)意味著，針對(duì)SARS-CoV產(chǎn)生的抗血清也導(dǎo)致SARS-CoV-2感染細(xì)胞的特征性熒光染色（圖3）。nsps出現(xiàn)在感染細(xì)胞的核周區(qū)，而N蛋白則分布在胞漿中。在高爾基體中檢測(cè)到M蛋白。



圖3: SARS-CoV-2感染VeroE6細(xì)胞后用兔SARS-CoV抗血清處理的免疫熒光顯微鏡。Nsps位于細(xì)胞核附近，M蛋白位于高爾基體?？筪sRNA抗體用于標(biāo)記病毒RNA合成的復(fù)制中間產(chǎn)物。細(xì)胞核用Hoechst染色。（a）和（b）的比例尺為25 μm；（c）、（d）和（e）的比例尺為100 μm。圖片來源：Ogando et al., Journal of General Virology (DOI 10.1099/jgv.0.001453)。

正置熒光顯微鏡在病毒學(xué)研究中的潛力
Ogando等人的研究中描述的交叉反應(yīng)抗血清將是特征性SARS-CoV-2復(fù)制周期的實(shí)用工具。這個(gè)工具反過來能使研究人員能夠確定復(fù)制抑制劑的潛在目標(biāo)。

一個(gè)相對(duì)簡單的實(shí)驗(yàn)裝置-免疫熒光顯微鏡-足以得出病毒復(fù)制周期的結(jié)論。因?yàn)檫@種方法細(xì)胞生長在蓋玻片上，并安裝在玻片上，所以正置熒光顯微鏡是一種實(shí)用的解決方案。配備有電動(dòng)載物臺(tái)和采用寬視野（FOV）的自動(dòng)化掃片模塊幫助用戶快速獲取全玻片的圖像概覽。如果單視野快拍就能滿足需求，則機(jī)械式載物臺(tái)是更合理的選擇。